بررسی تنوع ژنهای کدکننده ی آنزیم بتاگلوکاناز در سویه های بومی باسیلوس جدا شده از محصولات زراعی- باغی کشور

بتاگلوکانازها از اعضای خانواده گلیکوزید هیدرولازها بوده که هیدرولیز پیوند‏های گلیکوزیدی بتا 1و 4 را در بتاگلوکان‏ها کاتالیز می‏کنند. این گروه از آنزیم¬ها براساس شباهت توالی¬های اسید آمینه نواحی کاتالیتکی خود در 15 خانواده از 86 خانواده گلیکوزید هیدرولازها گروه بندی شده¬اند. در این پژوهش هدف، تعیین توالی ژن های کد کننده آنزیم بتاگلوکاناز و طبقه بندی سویه های مورد بررسی بر اساس نوع خانواده آنزیمی و تعیین شرایط بهینه کاتالیتیکی آنزیم های تولیدی به روش سطح پاسخ بود. در این بررسی 27 سویه از bacillus subtilis جدا شده از باغات و مزارع کشور بر اساس توانایی تولید آنزیم بتاگلوکاناز، غربال شده و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، ژن آنزیم بتاگلوکاناز تکثیر، تعیین توالی و در پایگاه اطلاعاتیncbi ثبت شد. آنالیز توالی¬های به دست آمده و رسم درخت فیلوژنی با استفاده از نرم¬افزار vector nti وmega.4 انجام شد. مقایسه توالی آمینواسیدی ژن¬های اندوبتا 1و4 گلوکاناز در جدایه¬های مورد بررسی نشان داد که تمام جدایه¬ها دارای ژن¬های مذکور بوده و به ترتیب در خانواده¬های گلیکوزید هیدرولازهای 5 و16 قرار می¬گیرند. همچنین جدایه¬های مورد مطالعه خانواده 5 گلیکوزید هیدرولازها براساس تنوع در توالی آمینواسیدی ژن اندو بتا1و4 گلوکاناز در 11 گروه طبقه بندی شدند. همچنین فعالیت آنزیمی، آنزیم¬های تولید شده توسط 30 سویه که فعالیت آنزیمی بهتری داشتند را در 3 تیمار دمایی 30،55 و70 درجه سانتی گراد و در ph 6/4 مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج حاصله 8 سویه s7e ، t37a ، k2b، k36p88، h14h ، h14d ، d3d و b5d با توجه به دامنه فعالیت آنزیمی و تنوع گیاه میزبان، برای تعیین شرایط بهینه فعالیت بتاگلوکانازی به روش سطح پاسخ و با طرح مرکب مرکزی و با متغیرهای دما، ph و غلظت سوبسترا مورد مطالعه قرار گرفتند. با توجه به نتایج حاصل سویه های s7e، t37a، k36p88، h14h ، h14d ، d3d و b5d در ph اسیدی و نزدیک به خنثی و رنج دمای 35-65 درجه سانتی گراد اپتیمم فعالیت را داشتند.سویه k2b برخلاف سویه های فوق در ph قلیایی نیز فعالیت قابل قبولی را داشت. بیشترین اثر فعال کننده و بازدارنده فعالیت آنزیمی به ترتیب مربوط به منگنز و جیوه در غلظت 10 میلی مولار بود. بتاگلوکاناز¬های سویه های مورد بررسی در غلظت¬های مختلف سدیم کلرید کاهش شدید فعالیت آنزیمی را داشتند و حضور اتانول 5 درصد تأثیری زیادی بر فعالیت آنزیم¬ها نداشت.